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DNBSEQ? 測序技術(shù)

華大智造基因測序儀采用先進(jìn)的DNBSEQ?核心技術(shù),通過儀器氣液系統(tǒng)先將DNA納米球(DNA nanoball, DNB)泵入到規(guī)則陣列載片(Patterned Array)并加以固定,然后再將測序模板及測序試劑泵入。泵入后的測序模板與載片上的DNB的接頭互補雜交,在DNA聚合酶的催化下,測序模板與測序試劑中的帶熒光標(biāo)記的探針相結(jié)合。接下來,通過激發(fā)熒光基團(tuán)發(fā)光,不同熒光基團(tuán)所發(fā)射的光信號被儀器相機(jī)采集,經(jīng)過處理后可轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號,傳輸?shù)接嬎銠C(jī)進(jìn)行再次處理,最終獲取待測樣本的堿基序列信息。


所有跟DNB相關(guān)的測序技術(shù)都屬于DNBSEQ?。DNBSEQ?測序技術(shù)主要包括:DNA單鏈環(huán)化和DNB制備(Make DNB),規(guī)則陣列(Patterned Array),DNB 加載(Load DNB), cPAS (combinatorial Probe Anchor Synthesis,聯(lián)合探針錨定聚合測序法),雙端測序技術(shù)(Pair-end),以及配套的流體和光學(xué)檢測技術(shù)、堿基識別(Basecall)算法等。


與其他測序技術(shù)相比, DNBSEQ?測序技術(shù)具有滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增帶來的錯誤累積低和規(guī)則陣列載片帶來的信號密度高等原理性優(yōu)勢,大幅提高了測序準(zhǔn)確性;而且,基于DNBSEQ?測序平臺的產(chǎn)出數(shù)據(jù)重復(fù)序列率低(Dup率低)、有效數(shù)據(jù)利用率高、標(biāo)簽跳躍少(Index Hopping少),能有效降低“張冠李戴”的情況。此外,結(jié)合PCR free等建庫方法,DNBSEQ?測序平臺擁有更好的SNP和InDel準(zhǔn)確性。

DNB制備技術(shù)

DNB制備技術(shù)包括DNA單鏈環(huán)化及DNB 制備。


DNA單鏈環(huán)化

是將帶有接頭序列的雙鏈DNA(Double- stranded DNA, dsDNA),通過高溫變性形成單鏈DNA(Single-stranded DNA, ssDNA),環(huán)化引物與SSDNA的兩端互補配對,在連接酶的催化下,SSDNA的首尾相連接,形成單鏈環(huán)狀DNA(Single-strand circular DNA, sscirDNA)。




DNB制備

以單鏈環(huán)狀DNA為模板,在DNA聚合酶作用下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling Circle Amplification, RCA),將單鏈環(huán)狀DNA擴(kuò)增到100-1000拷貝,擴(kuò)增產(chǎn)物稱為DNB。DNB通過簡單的質(zhì)量濃度質(zhì)控后,就可以用于下一步的上機(jī)測序,操作簡單,且不需要昂貴的定量設(shè)備和耗材。

基于RCA的線性擴(kuò)增技術(shù),每次擴(kuò)增都是以原始的DNA單鏈環(huán)為模板,使用保真性極高的聚合酶,使得在DNB的所有拷貝的同一個位置上出同樣的錯的幾率幾乎是零。RCA擴(kuò)增技術(shù)有效的避免了PCR擴(kuò)增錯誤指數(shù)積累的問題,從而大大提高測序的準(zhǔn)確性。



規(guī)則陣列載片和DNB加載


規(guī)則陣列載片

采用先進(jìn)的半導(dǎo)體精密加工工藝,在載片表面形成結(jié)合位點陣列,實現(xiàn)DNB的規(guī)則排列吸附。所有活性位點間距保持整齊一致,每個位點只固定一個DNB,可保證不同納米球的光信號不會互相干擾,這不僅保證了測序準(zhǔn)確度,而且提高了測序載片的利用效率,提供了極好的成像效率和最優(yōu)的試劑用量。

DNB加載

DNB在酸性條件下帶負(fù)電,在表面活化劑的輔助下,通過正負(fù)電荷的相互作用,被加載到載片中有正電荷修飾的活化位點的過程,稱為DNB加載。DNB與載片上活化位點的直徑大小相當(dāng),盡可能避免了多個DNB 結(jié)合到同一個位點的情況,從而大大提高了DNB的有效利用率。
cPAS技術(shù)

在DNA聚合酶的催化下,將測序引物錨定分子和熒光探針在DNB上進(jìn)行聚合,洗脫掉未結(jié)合的探針后,在激光的作用下熒光信號被激發(fā),隨后利用高分辨率成像系統(tǒng)對光信號進(jìn)行采集、讀取和識別,從而獲得當(dāng)前待測堿基的序列信息,然后加入再生洗脫試劑,去除熒光基團(tuán),進(jìn)入下一個循環(huán)的檢測。

華大智造優(yōu)化了大量的反應(yīng)條件,從上萬個酶突變體中篩選得到最優(yōu)秀的測序酶,使生化反應(yīng)時間可以縮短到1分鐘以內(nèi)。



二鏈測序

在完成一鏈測序后,加入具有鏈置換功能的DNA聚合酶進(jìn)行DNA二鏈合成反應(yīng),在持續(xù)的延伸過程中,當(dāng)遇到雙鏈結(jié)構(gòu)的時候,在DNA聚合酶的解旋作用下,完成邊解旋邊復(fù)制的反應(yīng),形成大量的單鏈DNA作為二鏈測序的模板(圖5-中),然后雜交二鏈測序引物,開始二鏈的cPAS測序。

利用DNA聚合酶的鏈置換特性,實現(xiàn)了DNB的雙端測序,而且重新合成的二鏈拷貝數(shù)更多,能夠獲得更強的熒光信號,有效的提高了測序的準(zhǔn)確性。


堿基識別算法

旨在根據(jù)各個通道的光信號強度完成堿基識別并計算每個堿基的質(zhì)量得分。通過對已有數(shù)據(jù)模型的訓(xùn)練,建立信號的特征和測序錯誤的對應(yīng)關(guān)系,在進(jìn)行堿基識別的時候,根據(jù)每個堿基的信號特征輸出預(yù)估的錯誤率。 質(zhì)量得分根據(jù)phred-33質(zhì)量得分標(biāo)準(zhǔn)。

華大智造自主開發(fā)的Sub-pixel Registration算法,使圖像配準(zhǔn)精確度達(dá)到了亞像素級別,大大提高了堿基識別的準(zhǔn)確度。

此外,通過GPU加速的方法,在更高精度的算法條件下實現(xiàn)了200倍以上的加速,在提高識別準(zhǔn)確率的同時實現(xiàn)了圖像處理和堿基識別的實時化,數(shù)據(jù)處理速度處于同行業(yè)領(lǐng)先水平。

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